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Genome-TALER™ 人类 AAVS1 Safe Harbor 基因敲入试剂盒及敲入克隆

-TALEN介导,靶向人类基因组上安全港位点的基因敲入实验体系

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通过在染色体上的特定位点插入感兴趣的基因或其他遗传因子,对改造人类基因组进行改造——这项实验在细胞工程上具有极大的价值。经过基因改造的细胞在医学研究、基因功能研究及族系跟踪和分析中扮演着重要角色。而所有这些应用都取决于转入基因功能的可靠性和可预测性,同时需要转入基因不扰乱内源基因和/或其他调控因子的功能。相反,随机整合的转入基因会带来不可预知的插入或突变,构成威胁。

最新的方法是将基因转入基因组上一个已知的安全位点。人类第19号染色体上的AAVS1(又名为PPP1R2C位点)就是这样一个经过验证的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构,能保证转入基因片段的功能。最重要的是,在该位点插入外源基因片段对细胞无已知的副作用。

 

Genome-TALER™ human AAVS1 safe harbor 基因敲入试剂盒 

该试剂盒专为转基因实验设计,通过TALEN介导的同源重组(HR)反应,将您感兴趣的基因、筛选标记或其他基因元件转入位于人类第19号染色体上的AAVS1 safe harbor位点。TALEN核酸酶特异剪切AAVS1位点,产生DNA双链断裂(DSBs),触发DNA的自然修复机制,诱导同源重组(HR)反应的发生。(图1)

 

Genome-TALER™ human AAVS1 safe harbor 基因敲入克隆 

这些基因敲入供体克隆有超过18,000条ORF可供选择 ,可搭配Genome-TALER™ human AAVS1 safe harbor 基因敲入试剂盒使用。这些克隆通过TALEN介导的同源重组(HR),将客户目标基因的ORF从AAVS1供体质粒靶向转入基因组上的AAVS1位点,确保基因的安全整合和单拷贝表达。

CRISPR20130724

图1: TALEN介导的将目标基因ORF敲入人类基因组AAVS1位点的原理图

 

优势

安全整合

  • AAVS1人类基因组safe-harbor位点能保证转入基因不被沉默,且无已知的副作用

特异靶向

  • 特异靶向AAVS1位点的TALEN介导DNA双链断裂,诱发同源重组,促使转入基因整合进入AAVS1位点

拷贝数已知

  • 已知转入基因的拷贝数,能确保其表达水平可被预测,简化表型解读。

ORF敲入亲和性

  • 超过18,000条经过序列验证的人类ORF可用于转入基因的供体克隆设计。

 

参考文献

1. Zou, J. et al. 2009. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2009 Jul 2;5(1):97-110

2. Sadelain, M. et al. 2011. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nat Rev Cancer. 2011 Dec 1;12(1):51-8.

3. van Rensburg, R. et al. 2013. Chromatin structure of two genomic sites for targeted transgene integration in induced pluripotent stem cells and hepatopoietic stem cells. Gene Therapy. 2013 20(2):201-14.

4. Papapetrou, EP. et al. 2011. Genomic safe harbors permit high ß-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 2011 29(1):73-8.

5. Lombardo, A. et al. 2011. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat. Methods. 2011 8(10):861-9.

 

Genome-TALER™ 人类 AAVS1 Safe Harbor 基因敲入试剂盒

试剂盒专为转基因实验设计,通过TALEN介导的同源重组,将您感兴趣的基因、筛选标记或其他遗传因子转入位于人类第19号染色体上的AAVS1 safe harbor位点。 试剂盒包含一对AAVS1 TALEN质粒,一个供体载体质粒或一个供体克隆质粒*,一个阳性对照供体克隆质粒以及两对基因敲入PCR 验证引物组合。

(A)  
AAVS1_Left_TALEN-m AAVS1_Right_TALEN-m
     
pDonor-ORF-SH01-s AAVS1_Donor_control-m  
(B)
20130723

图2. Safe harbor 基因靶标试剂盒。该试剂盒包含(A) (B) (A) TALEN 及供体DNA质粒;(B) Knock-in 验证PCR引物组合。

组成 描述 数量

AAVS1 TALEN 组合 – AAVS1左侧 TALEN 及AAVS1右侧 TALEN

特异剪切AAVS1靶标位点,产生双链断裂

1 对

AAVS1 供体载体

AAVS1 供体克隆*

用于克隆或已装载目标基因–两侧带有AAVS1同源重组位点
-含CMV启动子
-GFP报告基因/嘌呤霉素筛选标记

1

AAVS1 阳性对照供体克隆

装载RFP而非目标基因。用作阳性对照。

1

基因敲入验证引物组合

对同源重组连接位点进行扩增的引物组合,用于验证成功整合的克隆。

2 对

* 客户可为感兴趣的基因定制AAVS1供体克隆。该供体克隆将取代原来的空白AAVS1供体载体随试剂盒发货。

 

(A) (B)
20130719
(C)
20130723
(D)
TALENs-knockdown-eGFP-expression-53  

图 3. 人类基因组safe harbor AAVS1 基因靶标

(A) 于6孔板中用AAVS1 供体对照质粒DC-RFP-SH01 (800 ng) 与AAVS1 TALEN 克隆组合(600 ng 每个质粒) 或TALEN对照组共转染 HEK293T 感受态细胞. (B) 转染48小时后,将细胞以1:10比例分。配到新的6孔板,用1.0 µg/ml 浓度的嘌呤霉素进行筛选该图于筛选进行两周后拍摄。 DC-RFP-SH01  + TALEN对照组的板孔内只余极少量细胞。 (C) (D) 设计引物组合对同源重组连接位点进行扩增,验证成功整合的克隆。

鸣谢: AAVS1 左侧及右侧TALEN克隆, 以及AAVS1 供体对照载体由美国国家卫生研究院再生医学中心的Dr. Jizhong Zou 设计。

Genome-TALER™ 人类 AAVS1 Safe Harbor ORF 敲入克隆

Genome-TALER™ 人类 AAVS1 Safe Harbor ORF 敲入克隆是装载客户感兴趣的基因ORF的AAVS1供体克隆。该供体克隆可搭配Genome-TALER™ 人类 AAVS1 Safe Harbor 基因敲入试剂盒使用,将客户感兴趣的ORF特异敲入位于人类第19号染色体上的AAVS1位点。试剂盒中的TALEN组合靶向剪切AAVS1位点, 产生DNA双链断裂(DSBs),使该位点发生同源重组(HR)(图4)。目前这一系列敲入克隆有超过18,000条序列确证的人类OFR可供选择。

CRISPR20130724

图4: TALEN介导目标基因ORF敲入人类基因组AAVS1位点的原理图

AAVS1_Donor_clone-m

图5.人类 AAVS1 Safe Harbor ORF 敲入克隆

(A)

sy_20111121223148224632

(B)

图6:SOX2及OCT4基因敲入人类基因组safe harbor AAVS1 位点实验。(A)在六孔板上将OCT4(Cat#: DC-Z0092-SH01) 或SOX2(Cat#: DC-T2547-SH01) 供体质粒与AAVS1 TALEN组合共转染到HEK293T细胞。转染48小时后细胞传代,以嘌呤霉素(1µg/ml)筛选2周。转染48小时或筛选2周后用显微镜(Nikon Eclipse Ti ) 检查CopGFP的表达情况。只用供体质粒转染的对照组在嘌呤霉素筛选后只有少量细胞存活(数据未展示)。(B)对AAVS1位点稳定整合SOX2(Cat#: DC-T2547-SH01) 或 OCT4 (Cat#: DC-Z0092-SH01) 的HEK293T细胞进行分析。同个印迹实验中,阴性对照(未经转染的HEK293T细胞)的内源SOX2或OCT4蛋白水平低至无法检出。

Genome-TALER™ human AAVS1 safe harbor gene targeting kit

货号 产品 描述 价格

SH-AVS-K100

AAVS1 safe harbor 基因敲入试剂盒

包括:
AAVS1 TALEN 组合 (TN-AAVS1)
AAVS1供体载体(DC-DON-SH01)
AAVS1阳性对照供体克隆(DC-RFP-SH01)
基因敲入验证引物组合(HQPAVSHR)

¥15160

SH-AVS-K000

AAVS1 safe harbor 基因靶标试剂盒(不含供体克隆)

包括:
AAVS1 TALEN 组合 (TN-AAVS1)
AAVS1阳性对照供体克隆(DC-RFP-SH01)
基因敲入验证引物组合(HQPAVSHR)

¥13560

Variable

AAVS1 基因敲入 ORF 供体克隆

AAVS1 基因敲入 ORF 供体克隆。为您感兴趣的基因定制供体克隆。含CMV启动子。

¥5800或以上searchp

 

 

Genome-TALER™ TALEN和TALE定制服务

复能基因(Fulengen)提供TALENs,TALE-TFs和其他基于TALE的靶向基因组修饰因子的设计,构建和验证服务。

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