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生物素连接酶

生物素连接酶 (Biotin Ligase)由birA基因编码所得,能活化生物素形成生物素酰 -5'-腺苷酸,将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白(如AviTag 融合蛋白)上,使标签蛋白生物素化,也可用作生物素操纵子阻碍物。又名为:生物素操纵子阻碍蛋白(biotin operon repressor protein)、birA、生物素酶合成酶(biotin holoenzyme synthetase)、生物素-乙酰辅酶a羧化酶合成酶(biotin-[acetyl-CoA carboxylase] synthetase)。

来源:大肠杆菌 E. coli

储存缓冲液:50 mM咪唑;50 mM氯化钠;5%甘油;5 mM巯基乙醇;pH 6.8

储藏条件:本产品以干冰运送,送达后应立即分装储存于-80°C。长期保存置于-80℃,短期内使用置于-20℃,频繁使用可短时置于4℃。在4℃条件下保存三个月可保持>90% Ligase Buffer A、B和D-Biotin储存于-20℃,可反复冻融。

活性单位:≥7500 Units/μg

纯度:>95%

酶活性单位定义:底物蛋白(多肽)浓度为40 µM的条件下,于30℃孵育30 min,将 1 pmol蛋白(多肽)生物素化所需的酶量定义为一个活性单位。

 

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BI001 Biotin-Protein Ligase(1mg/ml) 将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白(如AviTag 融合蛋白)上,使标签蛋白生物素化 1000

 

 

产品使用指导

根据具体情况,应视乎反应体系添加生物素连接酶量,使生物素酰化在一合理的时间区间内进行(如下方图表所示)。通常,每10 nmol(浓度40 µM)底物建议对应2.5 µg 生物素连接酶,在30°C下反应30-40分钟,可达到最佳的生物素酰化效果。

   
 

需要注意的是,在不同生物缓冲液中存在的不同试剂可能抑制生物素连接酶活性,包括NaCl(100 mM)、甘油(5%)、硫酸铵(50 mM)。因此在反应体系中,这些试剂的浓度应尽量最小化。我们推荐将反应底物添加于pH 8,10 mM Tris-HCl中。

 
 

为提高生物素酰化效率,建议底物在最终反应体系的浓度尽可能高(最高可至40 µM)。反应体系的底物浓度越低,生物素酰化耗时越长。例如在使用同一birA酶的条件下,40 µM的底物反应时长是30分钟,4 µM的同一底物反应时长则为5小时。当生物素酰化过程需控制在30分钟内(例如反应速度提高10倍) ,体系中需添加的酶量为原有酶量的10倍。

 

Biotin Ligase Buffer A和Biotin Ligase Buffer B 已经过优化,可在底物(15-mer多肽)浓度不高于40 µM的情况下保持最优的生物素酰化效率。如底物浓度为40 – 80 µM,则需按以下内容配制反应体系:1份Buffer A、1份Buffer B、7份底物溶液、1份额外添加的生物素。如所需底物浓度高于80 µM,请致电技术支持:020-32069233。

 

生物素连接酶的相关菌株

AVB 100菌株

AVB100是一种大肠杆菌E. coli K12菌株 [MC1061 araD139 delta(ara-leu)7696 delta(lac)l74 galU galK hsdR2(rK-mK+) mcrB1 rpsL(Strr)]。该菌株的染色体带有稳定转入的birA基因。

在该菌株中,BirA蛋白的过表达可由阿拉伯糖诱导所得。稳定转入的birA基因不需使用抗生素维持。在AVB100使用IPTG诱导的载体如Avidity's pAC、pAN、pATN 和pATC AviTag载体,可独立调控目的基因及BirA的表达水平。该菌株仅限个人研究使用,不可分销,使用前请阅读产品的相关许可证明。

AVB99菌株

AVB99是一种带有pACYC184质粒的大肠杆菌E.coli (XL1-Blue),该质粒包含IPTG诱导的birA基因,可过表达生物素连接酶(pBirAcm),是一个低拷贝数的质粒。培养含该质粒的菌株可使用10 µg/mL浓度的氯霉素。

AVB101菌株

AVB101是大肠杆菌E. coli 的B菌株(hsdR, lon11, su1A1),内含pACYC184质粒,该质粒含有IPTG诱导的birA基因,可过表达生物素连接酶(pBirAcm)。该菌株生长快速且健康,不含添加OmpT或Lon蛋白酶,是理想的蛋白表达工具菌株。

生物素连接酶及AviTag蛋白的表达均由IPTG (1 mM)诱导。诱导阶段必须添加生物素,添加至其终浓度为50 µM。pAN及pAC载体需添加氨苄青霉素维持,抗生素浓度建议为100 µg/mL。

Avidity's AVB99及AVB101的质粒特性:

  • 质粒骨架为pACYC184;
  • 其中1.3 Kb片段含有插入了EcoRV位点的lacIq(因此可干扰tetR基因);
  • BirA由乳糖启动子操纵子调控表达;
  • rrnB终止子结构位于laqIq区域,可破坏pACYC184的XbaI位点。