Genome-CRISP™ CRISPR-Cas9 产品与服务

-RNA导向的精确、灵活的基因组编辑工具

介绍

CRISPR-Cas系统（The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。

在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM（5’-NGG-3’）为Cas9识别位点，是实现剪切功能的关键。

CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点

图 1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图

优势

RNA导向的基因组DNA识别，无需考虑DNA甲基化
较ZFN和TALEN，有相同或更高的基因编辑效率
可同时编辑多个基因（多重靶向编辑）
设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶

图2. CRISPR-Cas9介导的基因编辑。（左）：sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组，形成的DSBs被非同源末端连接（NHEJ）机制修复；（右）：sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组，形成DSBs，同源重组（HR）作用下，供体质粒上的目标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组。

图3: 切口酶在结合链生产单链切口的原理图

TALEN 与 CRISPR-Cas9 体系对比

特性	TALEN	CRISPR-Cas9
识别方式	蛋白质 – DNA	RNA-DNA
甲基化敏感性	敏感	不敏感
染色质结构敏感性	敏感	敏感
脱靶效应	较少观察到脱靶效应	潜在脱靶效应高于 TALEN 及ZFN
多靶点操作	极少用	可用

应用

基因组编辑应用

转录激活样效应因子（TAL Effectors）和CRISPR-Cas9可高效且精确地改造细胞系及模式动物的基因组。具体的基因组编辑应用可见下表。

基因组修饰	描述	基因组编辑工具	供体DNA
内源基因标记	利用上融合标签（如荧光素酶、GFP等）跟踪内源性启动子活性或内源性蛋白的表达与定位。	TALEN 或CRISPR	必需
内源基因突变	在内源基因序列中引入点突变	TALEN 或CRISPR	必需
内源基因敲除	引入缺失或插入（如：筛选标记）敲除内源基因	TALEN 或CRISPR	若需建立敲除细胞系，则强烈建议使用。
内源基因表达激活	靶向激活内源基因表达	TALE-TF或 CRISPR-TF	不适用
内源基因表达抑制	靶向抑制内源基因表达	TALE-R 或CRISPR-R	不适用
Safe harbor 位点敲入	敲入外源ORF或其他遗传因子到人或小鼠基因组的safe harbor位点	TALEN或CRISPR	必需

Cas9克隆

Genome-CRISP™ Cas9 核酸酶及 D10A 切口酶表达克隆

Cas9核酸酶克隆表达按照人类密码子优化过的Cas9核酸酶基因。Cas9切口酶克隆表达一个Cas9 D10A 切口酶基因。该切口酶是一个Cas9突变体，第10位氨基酸从野生型的天冬氨酸突变成了丙氨酸。

CRISPR-Cas9体系是由sgRNA和Cas9核酸酶构成的DNA靶向识别剪切复合体。sgRNA识别一段20bp、3端紧接着5'-N-G-G-3' PAM位点的DNA靶序列，Cas9核酸酶在该靶序列上生成DNA双链断裂（DSB）。DNA双链断裂（DSB）会被细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）机制修复。NHEJ机制容易在修复的断裂位点引入插入/缺失突变，造成阅读框移码而产生基因敲除的效果。同源重组（HR）需要细胞内同时存在一段带有靶点同源序列的供体DNA作为修复模板，我们可以通过对供体DNA进行设计，在众多实验体系中实现基因敲除或者敲入突变修饰、报告基因等等一系列基因组修饰。

Cas9 D10A切口酶跟野生型的Cas9一样，也使用sgRNA识别靶序列。但Cas9 D10A切口酶在靶序列上生成的是单链切口而非双链断裂。单链切口通常会由NHEJ和HR以外的机制完美地修复。但通过设计一对定向正确的sgRNA分别识别靶点两侧的DNA双链，我们可以诱导Cas9 D10A分别在靶点两侧的DNA双链上各生成一个单链切口，构成一个双链断裂（DSB），进而诱导NHEJ或HR修复机制。这种双切口策略常被用在要求低脱靶率的实验设计中。

订购	货号	产品	启动子	报告基因/筛选标记	价格（￥）
Cas9核酸酶表达克隆
	CP-C9NU-01	Cas9核酸酶表达克隆	CMV	mCherry / Neomycin	1000
Cas9核酸酶慢病毒表达克隆
	CP-LvC9NU-01	Cas9核酸酶慢病毒表达克隆	CMV	Neomycin	1000
	CP-LvC9NU-02	Cas9核酸酶慢病毒表达克隆	CMV	eGFP / Neomycin	1000
	CP-LvC9NU-08	Cas9核酸酶慢病毒表达克隆	EF1a	Puromycin	1000
	CP-LvC9NU-09	Cas9核酸酶慢病毒表达克隆	EF1a	eGFP / Neomycin	1000
	CP-LvC9NU-10	Cas9核酸酶慢病毒表达克隆	EF1a	eGFP / Hygromycin	1000
Cas9 D10A 切口酶表达克隆
	CP-C9NI-01	Cas9 D10A 切口酶表达克隆	CBh	N / A	1000
	CP-C9NI-02	Cas9 D10A 切口酶表达克隆	CMV	mCherry / Neomycin	1000
sgRNA克隆
	多种	sgRNA克隆	多种	多种

* 同时订购sgRNA克隆时价格减为￥2400

Genome-CRISP™ Cas9 稳定表达细胞株

直接转染或转导sgRNA便可进行基因组编辑实验。对于高通量实验尤其方便。

sgRNA克隆

Genome-CRISP™ sgRNA设计与克隆定制服务

GeneCopoeia为客户感兴趣的基因提供sgRNA（single-guide RNA）设计与克隆定制服务。sgRNA克隆表达一个单链的融合sgRNA（由crRNA和tracrRNA融合而成）。当Cas9核酸酶存在时，sgRNA能识别靶标DNA序列并引导Cas9核酸酶剪切靶标位点，形成DNA双链断裂（DSBs），进而实现基因敲除、敲入及突变等基因组编辑。多个sgRNA克隆与一个Cas9克隆共转染可同时在基因组中编辑多个位点，使实验设计更高效、更灵活。

载体类型

载体	启动子	sgRNA	Cas9核酸酶	筛选标记/报告基因	载体图谱
pCRISPR-SG01	U6	1 或多个	单独出售*	Hygromycin
pCRISPR-LvSG03	U6	1 或多个	单独出售*	Puromycin / mCherry
pCRISPR-CG02	U6	1	载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因	N/A
pCRISPR-CG04	U6	1或多个	载体含有CMV启动子启动表达的Cas9核酸酶基因	Neomycin / copGFP
pCRISPR-CG07	U6	1	载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因	copGFP
pCRISPR-CG08	U6	1	载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因	mCherry

*配合单独表达Cas9 核酸酶 (Cat.No. CP-C9NU-01, CP-LvC9NU-01, CP-LvC9NU-02) 或 Cas9 D10A 切口酶 (Cat.No.CP-C9NI-01, CP-C9NI-02) 的 Cas9 克隆使用。

购买	货号	产品名称	筛选标记	报告基因	价格（￥）
	CCPCTR01-CG02	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02.	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02.	N/A	1100
	CCPCTR01-CG04	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG04		1100
	CCPCTR01-CG07	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG07		1100
	CCPCTR01-CG08	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG08 with mCherry.		1100
	CCPCTR01-LvSG03	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-LvSG03	mCherry	1100
	CCPCTR01-SG01	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01	Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01	N/A	1100

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点击获取单靶点或多靶点sgRNA设计和克隆服务的报价。

(A)

(B)
	图4. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T细胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA与基因组PCR引物设计；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆与sgRNA/Cas9对照克隆（泳道2）转染HEK293T细胞。转染40h后收集细胞，提取基因组DNA并用HUWE特异的PCR引物进行PCR扩增，凝胶纯化PCR产物，将纯化后的产物与缓冲液混匀，经变性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI经PCR后的产物片段长度应为520bp，T7 ENI剪切后的产物应分别为330bp和190bp。

图5. CRISPR-Cas9多重靶向编辑多个基因。实验组（1-4泳道）为Cas9表达克隆及分别表达靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因的sgRNA克隆质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。对照组（5-8泳道）为Cas9表达克隆质及随机sgRNA表达克隆的质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。通过T7核酸内切酶检测分析基因组DNA各个靶点上同时存在的插入缺失。*号标记的条带显示Cas9核酸酶及分别靶向多个靶点的sgRNA都在目标靶点上有效地诱发了插入缺失突变（1-4道）。PCR产物条带及T7核酸内切酶酶切产物条带大小：GFP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).

服务

CRISPR-Cas9 客户定制服务

GeneCopoeia提供基于CRISPR-Cas9体系的靶向基因组修饰因子的设计，构建和验证服务。

优点

快速生产CRISPR-Cas9实验体系的质粒或mRNA
进行全序列验证，可直接用于转染
提供功能验证
可提供基因敲入供体克隆

服务	描述
验证服务
T7核酸内切酶 I 检测	染色体水平功能验证。通过检测CRISPR-Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）在染色体靶点上生成的插入缺失突变验证其功能。(图6& 图7)
供体克隆服务	供体克隆设计与构建	我们会依据您的实验需求，提供供体克隆客户定制服务。供体克隆能将您感兴趣的基因、筛选标记或遗传因子通过CRISPR-Cas9介导的同源重组整合到宿主细胞的基因组内。我们提供一系列含有不同筛选标记及遗传因子的供体载体设计以满足您的实验需求。.
稳转细胞株服务	单克隆细胞株	含有CRISPR-Cas9介导的基因组修饰的单克隆细胞系。
细胞库	为含有CRISPR-Cas9介导的基因组修饰的单克隆细胞系建库。
转基因小鼠服务	制作转基因小鼠	携带 CRISPR-Cas9 介导的基因组修饰的转基因小鼠

参考文献

Horvath P, Barrangou R (January 2010). "CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea". Science 327 (5962): 167–70.
Marraffini LA, Sontheimer EJ (February 2010). "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea". Nat Rev Genet 11 (3): 181–190.
Hale CR, Zhao P, Olson S, et al. (November 2009). "RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex". Cell 139 (5): 945–56.
van der Oost J, Brouns SJ (November 2009). "RNAi: prokaryotes get in on the act". Cell 139 (5): 863–5. doi:10.1016/j.cell.2009.11.018.
Hale CR, Zhao P, Olson S, et al. (November 2009). "RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex". Cell 139 (5): 945–56.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science 337, 816–821.
Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marrafﬁni, L.A. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat.Biotechnol. 31, 233–239.
Hsu, P.D., Scott, D.A.,Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V.,Li, Y., Fine, E.J., Wu, X., Shalem, O., et al. (2013). DNA targeting speciﬁcity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. Published online July 21, 2013.

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供体克隆定制及载体服务– GeneCopoeia提供标准或客户定制的供体克隆载体，用于基因敲除、突变修饰、融合标签及其他方面的应用。我们提供带有不同元件的多种载体骨架，可供客户根据自己的实验需要进行选择。
基因组编辑稳定细胞系构建服务 – GeneCopoeia提供使用TALEN或CRISPR-Cas9技术构建的基因组编辑稳定细胞系。我们的稳定细胞系服务也可以兼容我们的人类及小鼠safe harbor基因敲入体系。
转基因小鼠服务 – GeneCopeia 提供原核显微注射法生成的带有 CRISPR 或 TALEN 介导的基因组修饰小鼠。
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订购	货号	产品	描述	启动子	筛选标记/报告基因	载体	价格(￥)
	LPP-CP-LvC9NU-01-100	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，100 µL.	CMV	Neomycin	CP-LvC9NU-01	4500
	LPP-CP-LvC9NU-02-100	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，100 µL.	CMV	eGFP/Neomycin	CP-LvC9NU-02	4500
	LPP-CP-LvC9NU-08-100	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，100 µL.	EF1α	Puromycin	CP-LvC9NU-08	4500
	LPP-CP-LvC9NU-09-100	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，100 µL.	EF1α	eGFP/Neomycin	CP-LvC9NU-09	4500
	LPP-CP-LvC9NU-10-100	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，100 µL.	EF1α	eGFP/Hygromycin	CP-LvC9NU-10	4500
	LPP-CP-LvC9NU-01-400	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，400 µL.	CMV	Neomycin	CP-LvC9NU-01	7000
	LPP-CP-LvC9NU-02-400	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，400 µL.	CMV	eGFP/Neomycin	CP-LvC9NU-02	7000
	LPP-CP-LvC9NU-08-400	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，400 µL.	EF1α	Puromycin	CP-LvC9NU-08	7000
	LPP-CP-LvC9NU-09-400	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，400 µL.	EF1α	eGFP/Neomycin	CP-LvC9NU-09	7000
	LPP-CP-LvC9NU-10-400	Cas9 核酸酶纯化 Lentifect™ 慢病毒颗粒	1×106 – 1×107 TU/ml Cas9 核酸酶慢病毒颗粒，转导级，400 µL.	EF1α	eGFP/Hygromycin	CP-LvC9NU-10	7000

订购	新货号	产品	细胞系	筛选标记	Cas9 整合位点	产品规格	定价(￥)
	SL501	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类 H1299 单克隆细胞系	H1299	Puro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL502	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类 HEK293T 单克隆细胞系	HEK293T	Puro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	7600
	SL503	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类 HeLa 单克隆细胞系	HeLa	Hygro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL504	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类 A549 单克隆细胞系	A549	Hygro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL505	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类 HEK293T单克隆细胞系	HEK293T	Puro	AAVS1	1管，每管细胞数2 x10⁶	10000
	SL506	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a单克隆细胞系	Neuro2a	Puro	ROSA26	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL507	稳定表达诱导型 Cas9 核酸酶基因的人类 HEK293T 单克隆细胞系	HEK293T	Hygro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL508	稳定表达诱导型 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 单克隆细胞系	Neuro2a	Hygro	ROSA26	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL509	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 单克隆细胞系	Neuro2a	Hygro	ROSA26	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL510	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 单克隆细胞系	Neuro2a	Puro	ROSA26	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL511	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的小鼠 Neuro2a 单克隆细胞系	Neuro2a	Neo	ROSA26	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL514	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类MCF- 7单克隆细胞系	MCF- 7	Hygro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL515	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类MDA-MB-231单克隆细胞系	MDA-MB-231	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL516	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类MDA-MB-468单克隆细胞系	MDA-MB-468	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数2 x10⁶	10000
	SL517	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类T47D单克隆细胞系	T47D	Hygro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL518	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类HepG2单克隆细胞系	HepG2	Hygro	AAVS1	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL520	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类AGS单克隆细胞系	AGS	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL521	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类BxPC-3单克隆细胞系	BxPC-3	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL522	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类SNU475单克隆细胞系	SNU475	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数2×10⁶	10000
	SL523	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类HT-29单克隆细胞系	HT-29	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数 2×10⁶	10000
	SL524	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类MCF-7单克隆细胞系	MCF-7	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数 2×10⁶	10000
	SL526	稳定表达 Cas9 核酸酶基因的人类SNU‐1单克隆细胞系	SNU‐1	Hygro	随机整合	1管，每管细胞数 2×10⁶	10000