产品目录

Genome-CRISP™ CRISPR-Cas9 产品与服务

-RNA导向的精确、灵活的基因组编辑工具

  • 介绍
  • 应用
  • Cas9克隆
  • sgRNA克隆
  • 服务
  • 订购
  • 相关产品

CRISPR-Cas系统(The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems)是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物,包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示,与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)相比较,CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。

在II型CRISPR系统中,CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)退火形成的复合物能特异识别基因组序列,引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对;靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点,是实现剪切功能的关键。

CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点

Illustration-of-CRISPR_Cas9-mediated-genome-editing

图 1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图

优势

  • RNA导向的基因组DNA识别,无需考虑DNA甲基化
  • 较ZFN和TALEN,有相同或更高的基因编辑效率
  • 可同时编辑多个基因(多重靶向编辑)
  • 设计简单快速,无需重复构建核酸内切酶

参考文献

  • Horvath P, Barrangou R (January 2010). "CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea". Science 327 (5962): 167–70.
  • Marraffini LA, Sontheimer EJ (February 2010). "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea". Nat Rev Genet 11 (3): 181–190.
  • Hale CR, Zhao P, Olson S, et al. (November 2009). "RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex". Cell 139 (5): 945–56.
  • van der Oost J, Brouns SJ (November 2009). "RNAi: prokaryotes get in on the act". Cell 139 (5): 863–5. doi:10.1016/j.cell.2009.11.018.
  • Hale CR, Zhao P, Olson S, et al. (November 2009). "RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex". Cell 139 (5): 945–56.
  • Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science 337, 816–821.
  • Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat.Biotechnol. 31, 233–239.
  • Hsu, P.D., Scott, D.A.,Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V.,Li, Y., Fine, E.J., Wu, X., Shalem, O., et al. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. Published online July 21, 2013.

基因组编辑应用

转录激活样效应因子(TAL Effectors)和CRISPR-Cas9可高效且精确地改造细胞系及模式动物的基因组。具体的基因组编辑应用可见下表。

基因组修饰 描述 基因组编辑工具 供体DNA
内源基因标记 A加入融合标签(如荧光素酶、GFP等),跟踪内源性启动子活性或内源性蛋白的表达与定位。 TALEN 或CRISPR 必需
内源基因突变 在内源基因序列中引入点突变 TALEN 或CRISPR 必需
内源基因敲除 引入缺失或插入(如:筛选标记)敲除内源基因 TALEN 或CRISPR 若需建立敲除细胞系,则强烈建议使用。
内源基因表达激活 靶向激活内源基因表达 TALE-TF或 CRISPR-TF 不适用
内源基因表达抑制 靶向抑制内源基因表达 TALE-R 或CRISPR-R 不适用
Safe harbor 位点敲入 敲入外源ORF或其他遗传因子到人或小鼠基因组的safe harbor位点 TALEN或CRISPR 必需

 

 TALEN 与CRISPR-Cas9系统对比

特性 TALEN CRISPR-Cas9
识别方式 蛋白质-DNA RNA-DNA
甲基化敏感性 敏感 不敏感
染色质结构敏感性 敏感 敏感
脱靶效应 较低 潜在脱靶效应较TALEN和ZFN高
多重靶向编辑 极少使用 可使用

Genome-CRISP™ Cas9核酸酶表达克隆

Cas9核酸酶表达克隆装载并表达CRISPR关联蛋白(Cas)9号的基因序列。当crRNA与tracrRNA(或融合的sgRNA)存在时,Cas9核酸酶会被导向至宿主基因组中的靶点,引发双链断裂(DSBs)。随后,细胞的非同源末端连接修复机制(NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA,并引入插入或缺失突变。另一种情况是,一个外源双链供体DNA片段可以通过同源重组(HR)整合进断裂处的基因组。目前,CRISPR/Cas9系统已已用在人胚胎干细胞(ES)和诱导多功能干细胞(IPSCs)的基因修饰稳定株的制备,还用于大鼠,线虫,斑马鱼等基因敲除动物模型的构建。

CP-C9NU-01

图 2. Cas9核酸酶表达克隆质粒图谱

 

图3. CRISPR-Cas9介导的基因编辑。(左):sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组,形成的DSBs被非同源末端连接(NHEJ)机制修复;(右):sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组,形成DSBs,同源重组(HR)作用下,供体质粒上的目标基因及筛选标记(或其他遗传元件)在断裂处被整合进基因组。

 

 

Genome-CRISP™ Cas9切口酶表达克隆

Cas9切口酶表达克隆装载并表达工程酶Cas9切口酶的基因(图4)。野生型的Cas9蛋白含有两个催化结构域——一个切割sgRNA靶向识别的结合链,而另一个切割其互补链。Cas9 D10A切口酶基因的序列对比野生型在D10A位置有一个有义突变。这个有义突变使得切割互补链的催化结构域失活,将Cas9核酸酶转变成只在靶标序列的结合链切出单链缺刻的切口酶。

图4: Cas9切口酶表达克隆质粒图谱

图5: 切口酶在结合链生产单链缺刻原理图

 

Genome-CRISP™ sgRNA设计与克隆定制服务

GeneCopoeia为客户感兴趣的基因提供sgRNA(single-guide RNA)设计与克隆定制服务。sgRNA克隆表达一个单链的融合sgRNA(由crRNA和tracrRNA融合而成)。当Cas9核酸酶存在时,sgRNA能识别靶标DNA序列并引导Cas9核酸酶剪切靶标位点,形成DNA双链断裂(DSBs),进而实现基因敲除、敲入及突变等基因组编辑。多个sgRNA克隆与一个Cas9克隆共转染可同时在基因组中编辑多个位点,使实验设计更高效、更灵活。

 

载体类型

载体 启动子 sgRNA Cas9核酸酶 筛选标记/报告基因 载体图谱
pCRISPR-SG01 U6 1 或多个 单独出售 Hygromycin get_info
pCRISPR-CG01 U6 1或多个 载体含有CMV启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 Neomycin / mCherry get_info
pCRISPR-CG02 U6 1 载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因 N/A get_info

 

 

(A)  
HUWEI-sgRNA-design
(B)  
HUWEI-sgRNA_Cas9-clones

图6. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T细胞中的HUWEI基因。(A)HUWEI-sgRNA与基因组PCR引物设计;(B)在6孔板中,HUWEI-sgRNA/Cas9克隆与sgRNA/Cas9对照克隆(泳道2)转染HEK293T细胞。转染40h后收集细胞,提取基因组DNA并用HUWE特异的PCR引物进行PCR扩增,凝胶纯化PCR产物,将纯化后的产物与缓冲液混匀,经变性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI经PCR后的产物片段长度应为520bp,T7 ENI剪切后的产物应分别为330bp和190bp。

 

CRISPR-Cas9_multiplexing_to_target_multiple_genes

图7. CRISPR-Cas9多重靶向编辑多个基因。实验组(1-4泳道)为Cas9表达克隆及分别表达靶向p53, HUWE1, NCL3 和 GFP基因sgRNA克隆质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。对照组(5-8泳道)为Cas9表达克隆质及随机sgRNA表达克隆的质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。通过T7核酸内切酶检测分析基因组DNA各个靶点上同时存在的插入缺失。*号标记的条带显示Cas9核酸酶及分别靶向多个靶点的sgRNA都在目标靶点上有效地诱发了插入缺失突变(1-4道)。PCR产物条带及T7核酸内切酶酶切产物条带大小:GFP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切). 

 

CRISPR-Cas9 客户定制服务

GeneCopoeia提供基于CRISPR-Cas9体系的靶向基因组修饰因子的设计,构建和验证服务。

优点

  • 快速生产CRISPR-Cas9实验体系的质粒或mRNA
  • 进行全序列验证,可直接用于转染
  • 提供功能验证
  • 可提供基因敲入供体克隆

 

相关服务

服务 描述
验证服务 代理报告基因检测 细胞水平功能验证。通过共转染后检测报告基因的表达水平验证CRISPR-Cas9系统的功能。
T7核酸内切酶I 酶切检测 染色体水平功能验证。通过检测CRISPR-Cas9介导的非同源末端连接(NHEJ)在染色体靶点上生成的插入缺失突变验证其功能。(图6& 图7)
供体克隆服务 供体克隆设计与构建 我们会依据您的实验需求,提供供体克隆客户定制服务。供体克隆能将您感兴趣的基因、筛选标记或遗传因子通过CRISPR-Cas9介导的同源重组整合到宿主细胞的基因组内。我们提供一系列含有不同筛选标记及遗传因子的供体载体设计以满足您的实验需求。.
稳转细胞株服务 单克隆细胞株 含有CRISPR-Cas9介导的基因组修饰的单克隆细胞系。
细胞库 为含有CRISPR-Cas9介导的基因组修饰的单克隆细胞系建库。

 

供体载体类型

载体 启动子 报告基因 筛选标记 载体图谱
pDonor-01 EFa1 copGFP Puromycin get_info
pDonor-02 CMV copGFP Neomycin get_info
pDonor-03 CMV N/A Neomycin get_info
pDonor-04 CMV N/A Puromycin get_info
pDonor-05 EFa1 N/A Neomycin get_info
pDonor-07 EFa1 copGFP Puromycin/TK get_info
pDonor-08 CMV copGFP Neomycin/TK get_info
pDonor-09 EFa1 N/A Puromycin/TK get_info
pDonor-10 CMV N/A Neomycin/TK get_info
货号 产品 描述 价格(¥)
CP-C9NU-01 Cas9 核酸酶表达克隆 在宿主细胞中表达Cas9核酸酶。Cas9核酸酶能在sgRNA引导下剪切靶标DNA,形成双链断裂(DSBs)。

4800*

CP-C9NI-01 Cas9 切口酶表达克隆 在宿主细胞中表达Cas9切口酶。Cas9切口酶能在sgRNA引导下剪切靶标DNA的结合链,在其上造成单链缺刻。

4800*

不定 sgRNA 克隆 在宿主细胞中转录sgRNA。sgRNA能识别靶标DNA,并引导Cas9蛋白到靶点行使基因组编辑功能。

* 同时订购sgRNA克隆时价格减为¥2400

   Copyright© 2001-2015 广州复能基因有限公司 版权所有 粤ICP备10079716号