人类MicroRNA前体表达克隆和MicroRNA靶标表达克隆

MicroRNA ( miRNA)是从真核基因组转录形成的非编码单链小分子RNA。它们的序列高度保守，通常是21到23个核苷酸长度。近来研究发现miRNA几乎与所有细胞的功能和生物体生命过程有关。它们通过靶定到mRNA3’非翻译区（3’－UTR）来调节基因的表达。MicroRNA所调节基因的表达失调与癌症、心血管疾病、其他各种疾病有关。

复能基因现在提供:

• 600多种人类的OmicsLink™ microRNA前体表达克隆
• miRNA靶标的表达克隆编码基因的3’端非翻译区（3’－UTR）涵盖了人类编码基因20000个miRNA靶标表达克隆。（3’－UTR，即编码基因的3’端非翻译区）

利用这些miRNA表达克隆研究相应基因或者蛋白的表达调节情况。配合采用荧光素酶报告基因的靶标克隆，可以和miRNA表达克隆一起进行miRNA功能筛选合确证，以及miRNA靶标基因的筛选和确证的交互实验。

复能基因同时也提供多套的人类基因组和小鼠基因组的全长基因ORF表达克隆。用于miRNA靶标的对应蛋白的功能互补实验。由于这些ORF克隆不含3’－UTR，可以用于特种miRNA对内源靶基因抑制后的拯救实验，进一步确证miRNA功能及靶标基因。

OmicsLink™人类基因组的miRNA前体表达克隆       

复能基因采用基于猫免疫缺陷病的慢病毒系统，构建了miRNA前体表达克隆的载体骨架。RNA聚合酶III型的H1启动子驱动转录前体miRNA的茎环前体（大约有150核苷酸长度）。 随后通过RNAi的酶系加工生成成熟的miRNA。使得在同一载体的CMV启动子的驱动下共表达报告基因eGFP，双顺反子下游的嘌呤霉素筛选基因也同时表达。可作为监测miRNA表达，转染和转化的效率的参考标准。

RISC－miRNA复合体通过结合靶基因的mRNA的3’非编码区（3’－UTR）成功地调节靶基因。1）表达水平和翻译水平的抑制；2）mRNA的被切割，被降解和丰度的下降。

图1. 慢病毒骨架的pre-miRNA表达克隆介导的miRNA基因的调节

miRNA前体表达克隆的特征

• 650种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（11.0版本）中已知的678种miRNA的95%
• miRNA表达框已完全测序确证
• 基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率
• 提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定或瞬时表达调控
• 通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率

OmicsLink™ 人类基因组 3' UTR靶标表达克隆       

复能基因提供基于全人类基因组miRNA作用的靶标表达克隆，涵盖了公共数据库。miRNA靶标表达克隆包含SV40启动子驱动的报告基因（萤火虫荧光素酶）的下游紧接3’－UTR（即miRNA作用位点）序列。 第二个报告基因renilla luciferase，可用于监测转染，表达效率，并可以作内参。

通过萤火虫荧光素酶的活性分析，可获得miRNA对潜在靶标基因调控作用的结果。表达克隆转录后形成萤火虫荧光素酶ORF与3’UTR的嵌合体mRNA，如果有特异的miRNA可与3’－UTR某段序列互补结合，嵌合体中荧光素酶ORF所编码蛋白的活性也相应受到调控， 因此通过检测荧光素酶的发光强度就可以定量地测定miRNA对应靶标的mRNA调控的效果。

图2 人类基因组miRNA靶标表达克隆的特点

miRNA 前体和靶标表达克隆的应用

• 基因表达调控：通过转染或病毒颗粒感染的方式将单个或整套的miRNA导入培养细胞，进行单个miRNA或多个miRNA对基因的表达调控。对miRNA的调控效应和功能进行特定条件或体统化的研究
• miRNA靶标基因的确认和鉴定：利用miRNA靶标验证表达克隆，进行大规模的miRNA作用靶标基因的筛选和确证。一个miRNA可作用的所有靶标的基因，和可作用于一个mRNA的3’－UTR所有miRNA

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