定量PCR实验操作流程示例

一：实验目的

因现大部分定量PCR实验都为检测基因在mRNA水平的表达量，故本实验以检测mRNA水平的表达量为例，通过染料法(SYBR Green I)进行相对定量PCR实验，分析三个不同shRNA对LIN28的沉默效率

二：背景资料

• 样品为四个人源的细胞培养液，其编号分别为：control、shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3，其中control为对照组，其它三个为不同的样品组。
• 测试基因共两个：为LIN28（NM_024674），外加一内参基因GAPDH（NM_002046）；其中测试引物每个基因各提供了一对，共两对引物，经预实验验证，此两对引物没有非特异性扩增产物形成、同时不形成引物二聚体、其扩增效率基本相当。

三：实验内容

细胞RNA抽提、RNA反转录、定量PCR检测及其数据分析

四：实验主要仪器和试剂

• 主要实验仪器

冷冻离心机、常规PCR仪、分光光度计、电泳系统
iQ5 Real Time PCR Detection System

• 主要实验试剂

RIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA电泳缓冲液、
All-in-One™ First-Strand cDNA Synthesis Kit： GeneCopoeia (Cat. No. AORT-050 )
2×AllinOneTM qPCR Mix：GeneCopoeia (Cat.No. AOPR-0200)

五：实验操作

前期准备

为避免RNase 对RNA的降解及其提高实验的精确性，在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头，同时实验操作时，需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行。

RNA抽提

• 样品处理

先离心收集悬浮细胞，加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞

（Note：如为贴壁细胞，去培养基后可直接加入TRIzol(5~10×107细胞数加约为1mLTRIzol)，反复吹打裂解细胞，再收集TRIzol至离心管中；如为新鲜组织样品，可取50mg～200mg样品直接在液氮中研磨至粉末，再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中，反复振荡裂解组织细胞）。

• 相分离

室温放置上述样品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子，剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。

• RNA沉淀

小心吸取上清液约450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，12000g 冷冻离心10min（4℃）。

• RNA洗涤

去上清，加入500μL 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（4℃），去上清，再稍离，吸去上清液。

• RNA溶解

风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水约30μL。贴上标签后-80℃保存。

• RNA浓度测定

吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀释10倍后，在分光光度计Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。
（Note：如为常规的分光光度计，注意比色杯测定时的最少所需体积量，取一定量的RNA，用DEPC水稀释约100倍左右，同时在紫外条件下测定OD260和OD280，再按照公式计算RNA浓度＝40ng/μL×OD260×稀释倍数）

• RNA电泳检测
• 7.1．变性胶制备

取1.2g Agarose + 75mL去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。

• 7.2．电泳缓冲液配制(1×Mops)

取50mL10×Mops ，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中

• 7.3．RNA样品处理

取RNA样品约3μL，最后补充DEPC水至15μL，65℃变性10min后立即冷却，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可电泳

• 7.4．RNA电泳

先把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶拍照。

• RNA抽提结果
• 8.1 RNA电泳图（各3ul RNA 样品）：
• 8.2 RNA电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和A₂₆₀/A₂₈₀




泳道	RNA No.	RNA浓度(ng/ul)	A260/A280
1	Control	1734	1.94
2	shRNA-1	2621	1.95
3	shRNA-2	2348	1.93
4	shRNA-3	2680	1.95

反转录

• 融解All-in-One™ First-Strand cDNA Synthesis Kit中反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，进行短暂离心后放置冰上待用。
• RNA-Primer Mix 的配制反应（所有反应液的配置都在冰上操作）

在预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μL



试剂组分	体积	终浓度
total RNA		1μg/反应
60μM Oligo(dT)18 或250μM Random Primer	1μL 1μL	2.4μM 10μM
ddH2O（DNase/RNase Free）		至总体积13μL



• RNA变性

混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65℃变性10min后立即置冰上。

• 配制反转录反应液。


在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL



试剂组分	体积	终浓度
RNA-Primer Mix	13μL
5×RT Reaction Buffer	5μL	1×
25mM dNTP	1μL	1mM
25U/μL RNase Inhibitor	1μL	1 U/μL
M-MLV RTase	1μL	8 U/μL
ddH2O（DNase/RNase Free）	4μL
总体积	25μL




• 反转录反应

混匀反应Mix，短暂离心后42℃孵育1小时（Note：Oligo(dT)18反转录温度为42℃、Ramdom Primer反转录温度为37℃）。

• 灭活并保存反转录产物

反应结束后，85℃灭活处理5min, 最后-20℃保存反转录产物。

定量PCR实验

本次实验示例是采用染料法(SYBR Green I) 进行相对定量分析，实验设计是按照△△Ct解析法来进行设计。所使用仪器为iQ5 Real Time PCR Detection System(Bio-Rad) 实验步骤如下：

• 将2×AllinOneTM qPCR Mix在室温下融解，轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心。同时在使用过程中始终保持避光。
• 冰上进行PCR reaction mix的制备 (（所有反应都为三复孔实验，在实验中也设计了NTC（No Template Control），其为阴性对照，即在反应中用水来代替模板cDNA，其它试剂不变，从而来质控体系是否有污染)



试剂	用量	终浓度
2×AllinOneTM qPCR Mix ddH2O PCR Forward Primer(4μM) PCR Reverse Primer(4μM) cDNA(1:10dilute)	10μL 1μL 2μL 2μL 5μL	1× 0.4μM 0.4μM
总体积	20μL



• 2×AllinOneTM qPCR Mix设定为总反应体积的一半，其它组分请按最适比例进行调整。如需变更总反应体积，请保持最适条件下各组分的比例。
• Rox Reference Dye 使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR仪，如ABI的定量PCR仪。
• 引物终浓度可在0.2μM～0.4μM范围内调整，一般条件下0.2μM的量即可达到理想的效
• 1st Strand cDNA 通常需要稀释后再使用 ，防止反转录体系对qPCR体系的影响。迅速将 PCR reaction mix稍混匀，并加入96孔板中。
• 将96孔板进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
• PCR反应, 采用了标准的三步法程序进行反应：




循环数	步骤	温度	时间	检测
1	预变性	95℃	10min	Off
40	变性 退火 延伸	95℃ 57℃ 72℃	10sec 20sec 15sec	off off on

• 在PCR反应后，采用以下的程序进行熔解曲线分析：




温度	温度间隔	时间	检测
72 ℃～95℃	0.5℃	6sec/each	on
30℃		30sec	off




PCR程序的设置各公司仪器略有不同，具体请查看各公司仪器的说明资料或咨询实验室相关人员。

实验数据分析结果

• 内参基因GAPDH及其目的基因LIN28扩增结果查看



• LIN28表达量分析结果
• 2.1 LIN28表达量分析流程



样品	LIN28 Ave.Ct>	GAPDH Ave.Ct	LIN28 相对与GAPDH表达量（ΔCt）	与对照比较结果 （ΔΔCt）	表达量差异倍数 （2-ΔΔCt）
Control	20.96	16.87	4.09	0.00	1.00
shRNA-1	22.10	17.05	5.05	0.96	0.51
shRNA-2	22.87	17.13	5.75	1.65	0.32
shRNA-3	23.39	17.13	6.26	2.17	0.22



• 2.2 LIN28表达量差异示意图