OmicsLink™ shRNA表达克隆 
OmicsLink™ shRNA表达克隆是将针对靶基因设计shRNA（小发夹结构RNAi)靶点序列，然后将其装于表达载体中，我公司现可提供4套表达载体，可用于对人、小鼠、大鼠以及其他物种的全基因组范围的基因表达抑制研究。我公司还提供相应的全长人类和小鼠基因的ORF表达克隆，可用于相应基因的功能获得研究，还可用于shRNA克隆的确证。
图1. 使用H1 或 U6 启动子的表达载体构建的shRNA克隆。
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OmicsLink™ shRNA表达克隆原理
我公司提供基于shRNA技术的siRNA产品，可用于瞬时和稳定的基因表达抑制。表达质粒DNA或包含shRNA的病毒颗粒被导入靶细胞。使用哺乳动物启动子驱动目的序列的转录，序列经设计包括茎（19-29对核苷酸）和环，随后由RNAi机制中的酶加工成为成熟的siRNA，siRNA和RISC复合体对目的基因所转录的mRNA产生特异的切割降解作用，从而导致了基因表达抑制。 (见图2)
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OmicsLink™ shRNA表达克隆的特性
- 所有shRNA靶点序列的选取均经过准确算法计算。根据基因的不同， shRNA其茎的长度在19到29碱基对之间。这些保证shRNA克隆表达后有很高的表达抑制效率和最低的脱靶效应（off target effect）。
- 克隆shRNA 所采用的载体有慢病毒载体和以哺乳动物细胞为宿主的载体，各类载体拥有不同的启动子和跟踪标记基因可供选择。
- 载体中所带有的绿色荧光跟踪标记基因（ eGFP ）可以用于监测质粒载体的转染效率和转导病毒的感染效率。
- 载体结构上带有稳定细胞株的筛选标记（嘌呤霉素）和绿色荧光跟踪标记基因（EGFP ），这些特性使得该载体既能用于稳定抑制效应的研究，也可用于瞬时抑制效应的研究。
- 使用慢病毒载体系统，可转导shRNA进入常规的分裂细胞，以及不分裂而难以转染的目的细胞株。
- 载体的各部分序列已经过测序，包括启动子、编码shRNA的正义和反义链、发夹结构、终止子和其他接头序列。
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OmicsLink™ shRNA表达克隆的应用
- 基因表达下调 shRNA克隆对单个基因的基因表达抑制效应可以通过和一个包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。
- 信号通路研究 我公司的人类基因ORF克隆按照不同的信号传导、代谢、疾病通路和相关性、基因家族等进行了分类。将已知同一通路的shRNA克隆以96孔或384孔板的形式排列在一起，可一次研究一组基因在某一信号通路中的功能。目前我公司已可提供针对人类全部激酶基因的shRNA克隆，并已按照按不同激酶的功能进行了分类。
- ORF表达克隆确证 我公司已有shRNA相应人类靶基因的ORF克隆，可装在各种表达载体中，带有不同的标签和跟踪标记基因。这些正常的ORF表达克隆和在shRNA靶序列带有沉默突变的同样的ORF表达克隆，可以用于shRNA确认研究和基因功能拯救研究。
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OmicsLink™ shRNA表达克隆的基因表达抑制效应的检测方法
- q-RT-PCR检测 shRNA的表达，能导致目的基因所转录的mRNA被切割和降解，从而降低蛋白的表达，所以推荐检测表达抑制效应的第一步是做q-RT-PCR。我公司提供确证过的对应目的基因的q-RT-PCR引物（和其他已报导的转录体）。
- Western blot检测 检测表达抑制效应，大部分都需要用Western Blot方法来检测所表达蛋白表达水平的下调。我公司提供2500多种单克隆抗体和针对人类蛋白的多克隆抗体。
- 功能检测 检测表达抑制效应，还可通过生物和生化的终点分析方法，分析细胞增殖、克隆形成、细胞周期、细胞迁移等，根据目的基因具体的功能而定。
- 跟踪标记基因或蛋白进行功能检测 当所研究基因的内源转录水平很低，并且/或者q-RT-PCR和WB检测不适宜的时候， 表达抑制效应也可通过共转导shRNA克隆和一个含目的基因并带了跟踪标记基因的表达克隆，跟踪标记基因所编码的报告蛋白可用于功能检测。靶基因的mRNA遭shRNA的破坏，就同时导致了跟踪标记基因的mRNA遭破坏，从而表现为报告蛋白的表达下降。这样，表达抑制效应就可以用报告蛋白的酶活性分析结果来进行量化。（见图3）
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现已上市: 表达抑制效应已经过确证的人类激酶组shRNA表达克隆
- 人类激酶组中的350个激酶基因已有相应的构建好的shRNA表达克隆，立即可得。
- 所有shRNAs均是19mer，具有高的表达抑制效应和低的脱靶效应。
- shRNA靶序列已克隆到哺乳动物细胞表达载体psi-sH1，sH1用于启动shRNA的表达效率高。 psi-sH1载体同时还包含由CMV启动表达的GFP-Rluc双报告融合基因，该跟踪标记基因可用于检测转染效率。
- 这些shRNA克隆的表达抑制效应已经过一套跟踪标记基因功能分析系统确证（见图3）。具体为，首先构建包含有靶基因和一个跟踪标记基因AP的表达克隆piCheck-AP 。转录产生嵌合体mRNA，跟踪标记基因编码分泌型碱性磷酸酶（AP）。在没有shRNAs存在的情况下，AP基因稳定转录和翻译，靶基因的转录水平可通过AP酶活的检测测定（图3A）；而共转染靶基因的shRNA克隆及对应的piCheck-AP-ORF克隆，shRNA识别靶基因位点，导致嵌合体mRNA被降解，靶基因与AP基因翻译均下降，基因表达抑制的效果就可通过AP色度法定量检测（图3B）
图3.人类激酶组中部分激酶基因的shRNA克隆基因沉默效果确证。其中，shRNA克隆构建到psi-sH1载体中；表达克隆构建到piCheck-AP载体中，由CMV启动包括靶激酶基因和碱性磷酸酶（AP）基因的转录。AP活性可用比色测定法检测。A.没有shRNA存在，AP表达，其活性通过比色法测定。B.shRNA与AP-ORF表达克隆共转染，AP-ORF嵌合体mRNA被破坏，随后AP的翻译及其活性都降低。
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产品保证
shRNA表达克隆的表达框已经全长测序，包括启动子、正义和反义靶序列、发夹结构、终止信号及其他接头序列。 对于构建到psi-sH1载体中的人类激酶组shRNA克隆，我们每个基因提供1~3个克隆，所有克隆均已通过AP色度法确证其对靶基因的表达抑制水平达到70％以上。对于构建到慢病毒和哺乳动物载体的shRNA克隆，我们每个基因提供4个克隆。我们保证至少有1个克隆达到在mRNA水平对靶基因的表达抑制水平达到70%以上，前提是用前面所提的检测方法，并严格按照说明书所提供的操作流程和注意事项进行实验。如果经过我公司核实，的确4个中没有1个有所期望的表达抑制水平的话，我公司承诺免费更换1-4个shRNA克隆。
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RNA干扰技术
RNAi 即指RNA干扰，宿主细胞通过该机制剪切侵入微生物的双链RNA（dsRNA）。在多种组织和细胞中，通过RNA干扰途径，长的dsRNA能沉默靶基因的表达。通过一个和RNase III 酶相像的酶-Dicer，dsRNA能被剪切成20～25碱基的小干扰RNA（siRNA）。此后，siRNA被组装到一种叫做RNA诱导沉默复合物（RISCs）的包含有核糖核酸内切酶的复合物中。siRNA链随后指导RISC到碱基配对的靶mRNA分子，剪切破坏相应的mRNA。这是一种自然机制，宿主可通过该机制保护它们自己抵御那些在生命周期中需使用dsRNAs的外源微生物。
siRNAs 最初被认为是RNAi途径中由上述外源性dsRNA诱导产生的中间产物。尽管在所有物种中利用内源性siRNA对mRNA进行下游调控的生物机制仍大部分未知，科学家仍利用siRNA机制在多种实验系统中来抑制基因表达。RNA干扰应用最广泛的方法是通过体外化学合成大小在19～29个碱基对，含有3’突出端的dsRNA分子 ，它们被转入细胞后，能被掺入形成RISC-siRNA复合物，并随后进行基因下游调控。一旦每个转录本的靶序列被特异性、选择性的确定，这些化学合成的siRNA将成为一种十分有效的调节下游基因表达的工具，尤其是在反向基因工程领域中。（见图4）
图4. RNA干扰(RNAi)机制
