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Genome-TALER™ TALEN 和 TALE定制服务

– 随心所欲基因组编辑工具

    

介绍

TALEs首先是在植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的。当感染植物时，病原菌分泌的TALEs识别宿主植物靶基因的启动子区，调控相应基因的表达。TALE蛋白中间含有一个重复区域，该区域由33-35个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守，除了第12位和13位的两个氨基酸可变，即重复单元可变的双氨基酸残基（RVD）。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基，有如下一一对应关系：NI = A, HD = C, NG = T,NN = G 或 A。

转录激活因子样效应子(TAL effectors)已广泛应用于靶向基因组操作蛋白的制备：通过融合表达核酸酶、转录因子或其他功能的结构域构建位点特异的内切酶（TALEN）、靶基因转录调控因子（TALE-TFs）或者其他基因组修饰蛋白。TALE融合蛋白通过TALE特异性识别结合染色体上靶序列进行靶向基因组编辑，比如基因敲除、基因敲入（结合使用重组供体质粒）、基因组修饰、基因转录激活或抑制等。不同于识别3联体碱基的锌指蛋白，TALE单体通过一一对应的关系精确识别单个碱基（A, T, C, G），因此可以针对基因组上任意目标序列设计组建TALE模块。

优势

  • 靶向任意基因，无细胞类型限制
  • 靶点在基因组上序列高度特异
  • 可应用于基因敲除、基因敲入、基因修饰、基因激活或抑制等等
  • 灵活的结合域和功能域设计，可选择TALEN，TALE-TF或其他TAL效应子

 

图 1. TALEN设计示意图

 

图 2. TALE-TF设计示意图

TALEN 及 CRISPR-Cas9 体系应用对比

性能 TALEN CRISPR-Cas9
识别类型 蛋白质-DNA RNA-DNA
甲基化敏感性 敏感 不敏感
染色质结构敏感性         敏感 敏感
脱靶效应 较少观察到脱靶效应               潜在脱靶效应高于 TALENs 及 ZFNs        
多靶点 较少使用 可用

 

参考文献

  1. Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 2009 326(5959):1509-12
  2. Moscou, M. et al. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 2009 326(5959):1501
  3. Christian, M. et al. Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases. DOI: 10.1534/genetics.110.120717
  4. Morbitzera, R. et al. Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1013133107
  5. Cermak, T. et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12   e82 doi:10.1093/nar/gkr218
  6. Li, T. et al. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 14   6315–6325 doi:10.1093/nar/gkr188
  7. Zhang, F. et al. Programmable Sequence-Specific Transcriptional Regulation of Mammalian Genome Using Designer TAL Effectors. Nat Biotechnol. 2011 February ; 29(2): 149–153. doi:10.1038/nbt.1775.

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应用

基因组编辑应用

TAL 效应子和 CRISPR-Cas9 体系都能用于细胞系或模式生物的精确基因组修饰实验 。具体的一些基因编辑应用请见下表。

基因组修饰 描述 基因组编辑工具 供体 DNA
融合标签 通过融合标签修饰（如荧光素酶、 GFP）追踪内源启动子的活动或内源基因的表达与定位 TALEN 或 CRISPR 必须
基因突变 在内源基因序列上引入点突变 TALEN 或 CRISPR 必须
基因敲除 通过引入缺失或插入（如筛选标记序列）敲除内源基因 TALEN 或 CRISPR 强力推荐用于敲除细胞系筛选
表达激活 激活内源基因表达 TALE-TF 或 CRISPR-TF N/A
表达抑制 抑制内源基因表达 TALE-R 或 CRISPR-R N/A
Safe harbor 基因敲入 在人类或小鼠基因组的 safe harbor 位点敲入外源 ORF 或其他遗传因子 TALEN 或 CRISPR 必须

 

TALEN

TALEN 服务

    

TALEN是由TALE DNA结合结构域和FokI的DNA切割结构域融合构成。一对TALEN分别与两个相邻的靶点（相隔14-20bp）特异结合后，使得两个TALEN的FokI切割结构域靠近形成二聚体，发挥内切核酸酶活性，在两个靶位点之间剪切，产生双链断裂（DSBs）。DSBs诱发细胞内DNA损伤修复系统，非同源末端接合机制连接断裂的DNA时会产生碱基插入、缺失或者突变。另外，存在同源供体双链DNA片段时，同源重组可以将供体DNA整合进断裂位点。TALENs已用在人胚胎干细胞（ES）和诱导多功能干细胞（IPSCs）的基因修饰稳定株的制备，还用于大鼠，线虫，斑马鱼等基因敲出动物模型的构建。

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图 3. TALEN设计示意图

 

 
   
图4. TALEN介导的基因敲除。 （左图） TALEN介导的DNA双链断裂（DSBs）被非同源末端修复机制修复（NHEJ）。 （右图） TALEN介导的DNA双链断裂（DSBs）通过同源重组（HR）敲入供体质粒上的选择标记（或其他遗传因子）修复。

 

图 5. EGFP-TALENs体外切割靶DNA. (A) EGFP TALEN 靶向质粒(6110 bp) 含有一个EcoRI 酶切位点和一个eGFP TALENs的切割位点，相隔约1066 bp. (B)用相应的的酶（EcoRI或者EGFP-TALENs）和 1 µg 靶向质粒37°C孵育30 分钟后， 取一半的反应产物（约500 ng DNA）进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明EGFP-TALENs特异切割靶向质粒。*号所指的DNA片段通过PCR验证（未展示数据）
 

 

图 6. EGFP TALENs 下调靶基因eGFP的表达. (A) eGFP TALENs 表达检测：转染eGFP TALEN质粒到HEK293T细胞中（6孔板，转染0.8 µg质粒每孔)。 48小时后收集细胞，通过western blot检测EGFP-TALENs的表达（Flag标签抗体， SDS-PAGE分离胶浓度为8%，EGFP-TALEN分子量约110kDa）。 (B) EGFP TALENs 下调靶基因eGFP的表达: 共转染EGFP TALENs质粒和EX-EGFP-Lv105 (eGFP表达克隆)到6孔板中的HEK293T 细胞中。48小时后在显微镜下观察EGFP的表达水平。(Nikon Eclipse Ti, 曝光时间: 600ms)。.

 

(A)talen-tale-tf_F4_A-m

*靶向报告质粒中的Gluc报告基因中插入了TALEN靶点-终止密码子序列， 产生无义突变，不能表达Gluc。
**供体质粒中的野生型Gluc上游没有启动子，也不能表达Gluc。该野生型的Gluc可通过同源重组修复靶向报告质粒中的发生双链断裂的无义突变的Gluc（上游含CMV启动子），恢复Gluc的表达。

(B)

图 7. TALENs 促进同源重组 共转染eGFP-TALENs (1 µg)、靶向报告质粒 (0.5 µg) 和供体质粒 (0.5 µg)到HEK293T细胞中（6孔板）。 48小时后，检测同源重组修复Gluc的表达水平，以报告质粒中内参基因SEAP做校正因子。

 

TALE-TF

TALE-TF 服务

    

TALEs的一个重要应用是通过TALE DNA结合结构域与转录调控结构域融合，靶向激活或抑制细胞内靶基因的表达。TALE-TF结构是真核细胞内选择性调节基因表达的高度特异性的强大的工具。TALE-TF由TALE DNA结合结构域和VP64 转录激活子融合而成，可对真核细胞内靶基因进行精确激活。

图 8. TALE-TF设计示意图

购买 货号 产品 筛选标记 报告基因 价格
CTR001-TF-01 Scrambled control for TALE-TF Scrambled control for TALE-TF Scrambled control for TALE-TF 550

 

图 9. NTF3 TALE-TF 上调内源性NTF3的转录
转染 NTF3 TALE-TF到HEK293T细胞中 (6 孔板, 每孔转染1 µg 质粒) 。实时荧光定量PCR检测表明TALE-TF将HEK293T细胞内NTF3的表达水平提高了17倍左右（以空载体做对照）。

 

talen-tale-tf_F3

图 10. 合成的TALE激活因子对人类基因表达具有协同作用：(a) 一个TALE结构图。每个重复单元里被标出的氨基酸可识别以下碱基。

NLS：核定位序列；VP64/p65：激活区（ADs）。(b) 单一TALE以不同效率诱导靶标人类基因表达。 (c) 定点作用于任一DNA单链的TALEs可协同作用，有效地提高诱导率。(Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208)

 

服务

TALE定制服务

GeneCopoeia提供TALENs,TALE-TFs和其他基于TALE的靶向基因组修饰因子的设计，构建和验证服务。

优点

  • 快速生产TALE质粒或mRNA
  • 进行全序列验证，可直接用于转染
  • 提供功能验证
  • 可提供基因敲入供体克隆

 

相关服务

服务

服务内容

应用范围

验证服务

T7核酸内切酶I 酶切检测

染色体水平功能验证。通过检测TALEN介导的非同源末端连接（NHEJ）在染色体靶点上生成的插入缺失突变验证其功能。

TALEN

qPCR检测

染色体水平功能验证。通过测量靶基因表达水平的变化，验证TALE-TF的功能。.

TALE-TF

供体克隆服务

供体克隆设计与构建

我们会依据您的实验需求，提供供体克隆客户定制服务。供体克隆能将您感兴趣的基因、筛选标记或遗传因子通过TALEN介导的同源重组整合到宿主细胞的基因组内。我们提供一系列含有不同筛选标记及遗传因子的供体载体设计以满足您的实验需求。.

TALEN

稳转细胞株服务

单克隆细胞株

含有TALEN介导的基因组修饰的单克隆细胞系。

TALEN

细胞库

为含有TALEN介导的基因组修饰的单克隆细胞系建库。

TALEN
转基因小鼠服务 制作转基因小鼠 携带 TALEN 介导的基因组修饰的转基因小鼠 TALEN

 

供体载体类型

载体 启动子 报告基因 筛选标记 LoxP 位点 载体图谱
pDonor-D01 EF1a copGFP Puromycin N/A get_info
pDonor-D02 CMV copGFP Neomycin N/A get_info
pDonor-D03 CMV N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D04 CMV N/A Puromycin N/A get_info
pDonor-D05 EF1a N/A Neomycin N/A get_info
pDonor-D07 EF1a copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D08 CMV copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D09 EF1a N/A Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D10 CMV N/A Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D11 PGK copGFP Puromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D12 EF1a copGFP Hygromycin/TK LoxP get_info
pDonor-D13 PGK copGFP Neomycin/TK LoxP get_info
pDonor-D14 PGK N/A Puromycin/TK LoxP get_info

资源

用户手册

    Genome-TALER™ TALEN 及 TALE-TF 产品和服务 用户手册

     

    FAQs

    基因组编辑常见问题及 TALEN & TALE-TF FAQ

     

    技术说明

    Knockout by TALEN or CRISPR vs knockdown by shRNA or siRNA

    CRISPR-Cas9 specificity: Taming off-targent mutagenesis

    Genome editing: Which should I choose, TALEN or CRISPR?

    Genome editing in mammalian cells: What do I do next?

    Genome editing: check out these exciting donor clone applications! 

     

    应用说明

    GeneCopoeia genome editing tools for safe harbor integration in mice and humans

     

    综述文章

    Genome Editing Technology from GeneCopoeia

     

    参考文献

    • Richter, A. et al. Designer TALEs team up for highly efficient gene induction. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208
    • Perez-Pinera, P. et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 239-242
    • Maeder, M.L. et al. Robust synergistic regulation of human gene expression using TALE activators. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 243-245

     

    相关产品

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    供体克隆定制及载体服务– GeneCopoeia提供标准或客户定制的供体克隆载体，用于基因敲除、突变修饰、融合标签及其他方面的应用。我们提供带有不同元件的多种载体骨架，可供客户根据自己的实验需要进行选择。

     

    基因组编辑稳定细胞系构建服务 – GeneCopoeia提供使用TALEN或CRISPR-Cas9技术构建的基因组编辑稳定细胞系。我们的稳定细胞系服务也可以兼容我们的人类及小鼠safe harbor基因敲入体系。

     

    转基因小鼠服务 – GeneCopeia 提供原核显微注射法生成的带有 CRISPR 或 TALEN 介导的基因组修饰小鼠。

     

    Genome-CRISP™ CRISPR-Cas9 产品及服务——GeneCopoeia提供CRISPR-Cas9 sgRNA 设计及克隆服务，Cas9表达克隆和其他相关产品及服务，为客户实现简便快捷的靶向基因组编辑。

     

    Genome-TALER™ 及 Genome-CRISP™ 人类 AAVS1 Safe Harbor 基因敲入试剂盒及敲入克隆——试剂盒能通过 TALEN 或 CRISPR-Cas9 介导，将您的目的基因、筛选标记及其他遗传因子特异敲入人类第19号染色体上的 AAVS1 safe harbor 位点。我们有超过20,000条经过序列确证的人类ORF可用于构建 AAVS1 ORF 供体克隆。AAVS1 位点的安全整合能保证敲入基因被正常转录，并对细胞无已知的副作用

     

    Genome-TALER™ 及 Genome-CRISP™ 小鼠 ROSA26 safe harbor 基因敲入试剂盒及敲入克隆——试剂盒能通过 TALEN 或 CRISPR-Cas9 介导，将您的目的基因、筛选标记或其他遗传因子特异敲入小鼠基因组中的 ROSA26 safe harbor 位点。这样的安全敲入能保证转入基因的转录活性，并对细胞无已知的副作用。