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Genome-TALER™  TALEN和TALE定制服务

靶向基因组操作

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  • 服务
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TALEs首先是在植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的。当感染植物时,病原菌分泌的TALEs识别宿主植物靶基因的启动子区,调控相应基因的表达。TALE蛋白中间含有一个重复区域,该区域由33-35个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守,除了第12位和13位的两个氨基酸可变,即重复单元可变的双氨基酸残基(RVD)。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基,有如下一一对应关系:NI = A, HD = C, NG = T,NN = G 或 A。

转录激活因子样效应子(TAL effectors)已广泛应用于靶向基因组操作蛋白的制备:通过融合表达核酸酶、转录因子或其他功能的结构域构建位点特异的内切酶(TALEN)、靶基因转录调控因子(TALE-TFs)或者其他基因组修饰蛋白。TALE融合蛋白通过TALE特异性识别结合染色体上靶序列进行靶向基因组编辑,比如基因敲除、基因敲入(结合使用重组供体质粒),基因组修饰、基因转录激活或抑制等。不同于识别3联体碱基的锌指蛋白,TALE单体通过一一对应的关系精确识别单个碱基(A, T, C, G),因此可以针对基因组上任意目标序列设计组建TALE模块。

优点

  • 靶向任意基因,无细胞类型限制
  • 靶点在基因组上序列高度特异
  • 灵活的TALEN,TALE-TF或其他TAL效应子的设计选择
  • 完备的多层次服务
  • 细胞外或者细胞内的功能验证

图 1. TALEN设计示意图

图 2. TALE-TF设计示意图

参考文献

  • Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 2009 326(5959):1509-12
  • Moscou, M. et al. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 2009 326(5959):1501
  • Christian, M. et al. Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases. DOI: 10.1534/genetics.110.120717
  • Morbitzera, R. et al. Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1013133107
  • Cermak, T. et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12   e82 doi:10.1093/nar/gkr218
  • Li, T. et al. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 14   6315–6325 doi:10.1093/nar/gkr188
  • Zhang, F. et al. Programmable Sequence-Specific Transcriptional Regulation of Mammalian Genome Using Designer TAL Effectors. Nat Biotechnol. 2011 February ; 29(2): 149–153. doi:10.1038/nbt.1775.

TALE定制服务

GeneCopoeia提供TALENs,TALE-TFs和其他基于TALE的靶向基因组修饰因子的设计,构建和验证服务。

Genome TALER™ Custom TALEN and TALE TF General Guide

优点

  • 快速产生TALE质粒或mRNA转录子
  • 进行全序列验证,可直接用于转染
  • 提供功能验证
  • 可提供基因敲入的供体质粒
 
服务 Genome-TALER Engineer™ Genome-TALER Value™  Genome-TALER EssentialTM™  Genome-TALER Premium™  Genome-TALER Project™ 
  2 周 3-5 周 3-5 周 7-8 周 咨询
基因组编辑工具设计  
克隆构建及测序  
质粒水平功能验证       
染色体水平功能验证      
其他客户定制服务        

相关服务

服务 描述 应用
验证服务 代理报告基因检测 质粒水平功能验证。通过共转染后检测报告基因的表达水平验证基因组编辑工具的功能。 TALEN, TALE-TF
T7 染色体水平功能验证。通过检测TALEN介导的非同源末端连接(NHEJ)在染色体靶点上生成的插入缺失突变验证其功能。 TALEN
qPCR 检测 染色体水平功能验证。通过测量靶基因表达水平的变化,验证TALE-TF的功能。 TALE-TF
供体克隆服务 供体克隆设计与构建 我们会依据您的实验需求,提供供体克隆客户定制服务。供体克隆能将您的目的基因、筛选标记或遗传因子通过TALEN介导的同源重组(HR)整合到宿主细胞的基因组靶点。我们提供一系列含有不同筛选标记及遗传因子的供体载体设计以满足您的实验需求。
TALEN
稳转细胞株服务 单克隆细胞株 含有TALEN介导的基因组修饰的单克隆细胞系。 TALEN
细胞库 为含有TALEN介导的基因组修饰的单克隆细胞系建库。 TALEN

  • 供体克隆设计与构建服务
  • 复能基因提供供体克隆设计及构建服务。供体克隆装载客户定制的目的基因、筛选标记及其他遗传因子,通过基因组编辑工具介导的同源重组(HR)将所装载的片段整合到基因组上的靶点。复能基因提供含有不同筛选标记及遗传因子的多种供体载体供客户选择。

     

    供体载体类型

    载体 启动子 报告基因 筛选标记 载体图谱
    pDonor-01 EFa1 copGFP Puromycin get_info
    pDonor-02 CMV copGFP Neomycin get_info
    pDonor-03 CMV N/A Neomycin get_info
    pDonor-04 CMV N/A Puromycin get_info
    pDonor-05 EFa1 N/A Neomycin get_info
    pDonor-07 EFa1 copGFP Puromycin/TK get_info
    pDonor-08 CMV copGFP Neomycin/TK get_info
    pDonor-09 EFa1 N/A Puromycin/TK get_info
    pDonor-10 CMV N/A Neomycin/TK get_info

    TALEN 服务

    TALEN是由TALE DNA结合结构域和FokI的DNA切割结构域融合构成。一对TALEN分别与两个相邻的靶点(相隔14-20bp)特异结合后,使得两个TALEN的FokI切割结构域靠近形成二聚体,发挥内切核酸酶活性,在两个靶位点之间剪切,产生双链断裂(DSB)。DSB诱发细胞内DNA损伤修复系统,非同源末端接合机制连接断裂的DNA时会产生碱基插入、缺失或者突变。另外,存在同源供体双链DNA片段时,同源重组可以将供体DNA整合进断裂位点。TALENs已用在人胚胎干细胞(ES)和诱导多功能干细胞(IPSCs)的基因修饰稳定株的制备,还用于大鼠,线虫,斑马鱼等基因敲出动物模型的构建。

    图 3. TALEN设计示意图

    图 4. EGFP-TALENs体外切割靶DNA. (A) EGFP TALEN 靶向质粒(6110 bp) 含有一个EcoRI 酶切位点和一个eGFP TALENs的切割位点,相隔约1066 bp. (B)用相应的的酶(EcoRI或者EGFP-TALENs)和 1 µg 靶向质粒37°C孵育30 分钟后, 取一半的反应产物(约500 ng DNA)进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明EGFP-TALENs特异切割靶向质粒。*号所指的DNA片段通过PCR验证(未展示数据)
      

    图 5. EGFP TALENs 下调靶基因eGFP的表达. (A) eGFP TALENs 表达检测:转染eGFP TALEN质粒到HEK293T细胞中(6孔板,转染0.8 µg质粒每孔)。 48小时后收集细胞,通过western blot检测EGFP-TALENs的表达(Flag标签抗体, SDS-PAGE分离胶浓度为8%,EGFP-TALEN分子量约110kDa)。 (B) EGFP TALENs 下调靶基因eGFP的表达: 共转染EGFP TALENs质粒和EX-EGFP-Lv105 (eGFP表达克隆)到6孔板中的HEK293T 细胞中。48小时后在显微镜下观察EGFP的表达水平。(Nikon Eclipse Ti, 曝光时间: 600ms).

    图6A

     

    *靶向报告质粒中的Gluc报告基因中插入了TALEN靶点-终止密码子序列, 产生无义突变,不能表达Gluc。
    **供体质粒中的野生型Gluc上游没有启动子,也不能表达Gluc。该野生型的Gluc可通过同源重组修复靶向报告质粒中的发生双链断裂的无义突变的Gluc(上游含CMV启动子),恢复Gluc的表达。

    图6B

    图 6. TALENs 促进同源重组 共转染eGFP-TALENs (1 µg)、靶向报告质粒 (0.5 µg) 和供体质粒 (0.5 µg)到HEK293T细胞中(6孔板)。 48小时后,检测同源重组修复Gluc的表达水平,以报告质粒中内参基因SEAP做校正因子。

    TALE-TF 服务

    TALEs的一个重要应用是通过TALE DNA结合结构域与转录调控结构域融合,靶向激活或抑制细胞内靶基因的表达。TALE-TF结构是真核细胞内选择性调节基因表达的高度特异性的强大的工具。TALE-TF由TALE DNA结合结构域和VP64 转录激活子融合而成,可对真核细胞内靶基因进行精确激活。

    图 7. TALE-TF设计示意图

     

    图 8. NTF3 TALE-TF 上调内源性NTF3的转录
    转染 NTF3 TALE-TF到HEK293T细胞中 (6 孔板, 每孔转染1 µg 质粒) 。实时荧光定量PCR检测表明TALE-TF将HEK293T细胞内NTF3的表达水平提高了17倍左右(以空载体做对照)。

    图 9. 合成的TALE激活因子对人类基因表达具有协同作用:(a) 一个TALE图。每个重复单元里被标出的氨基酸可识别以下碱基。

    NLS:核定位序列;VP64/p65:激活区(ADs)。(b) 单一TALEs以不同效率诱导目标人类基因。 (c) 定点作用于任一DNA链的TALEs复合体可有效地提高基因诱导率。(Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208)

    参考文献

    1. Richter, A. et al. Designer TALEs team up for highly efficient gene induction. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208
    2. Perez-Pinera, P. et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 239-242

    Maeder, M.L. et al. Robust synergistic regulation of human gene expression using TALE activators. Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 243-245

  • Genome-TALER™人类AAVS1 safe harbor基因敲入试剂盒及敲入克隆——通过TALEN介导的同源重组(HR)反应,将您的目的基因、筛选标记或其他遗传因子整合到人类第19号染色体上的AAVS1 safe harbor位点。兼容的AAVS1敲入克隆有超过18000条经过序列确证的ORF可供选择。 Safe harbor位点的安全整合能确保转入基因的转录活性,且无已知的副作用。
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