HaloTag™ Technology, Expression-ready ORF cDNA Clone Collection

简介

HaloTag®是活细胞和固定细胞多色细胞成像实验的首选系统。这种多功能标签可以特异地与多种配体共价结合，能够在体内体外方便地对标签蛋白加荧光基团和纯化。

HaloTag®也能提高蛋白的表达量和可溶性，因此可以用于许多下游应用。

技术

HaloTag®标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag®配体有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核或真核系统中表达。

与OmicsLink™即用型表达克隆结合使用

GeneCopoeia提供带有HaloTag®、CMV启动子、新霉素筛选标记的哺乳动物细胞和慢病毒的表达载体。可以订购带有HaloTag®标签的20,000多种人和15,000多种小鼠的基因。

特异性

HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合，可以检测和固定标签蛋白。点击查看GeneCopoeia可以提供的报告基因和配体列表

严格的质检和质量保证

OmicsLink clone collection里的所有ORF表达克隆源于验证过的全长cDNA克隆或高质量的人源cDNA组织文库。

寄送之前，GeneCopoeia对所有的克隆进行了严格的质检过程。

所有的ORF经过全长测序
通过PCR验证序列长度
通过酶切验证质粒的正确性

载体信息

带有HaloTag®的表达载体列表

Vector	Promoter	Host cell	Selection marker	Tag	Protease site
pReceiver-Lv64	CMV	Stem/primary cell	Neomycin	N-HaloTag	Tev protease
pReceiver-Lv65	CMV	Stem/ primary cell	Neomycin	C-HaloTag	Tev protease
pReceiver-M49	CMV	Mammalian	Neomycin	N-HaloTag	Tev protease
pReceiver-M50	CMV	Mammalian	Neomycin	C-HaloTag	Tev protease

图1. 带N-或C-端HaloTag®的OmicsLink即用型ORF表达克隆载体图

How it works

图2. HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合，可以检测和固定标签蛋白

应用实例

HaloTag®技术的应用

蛋白定位

过膜或是不过膜的HaloTag®配体都可以标记胞内和膜上的蛋白。这些被标记的蛋白可以使用荧光显微镜来观察 (Figure 1). 不能过膜的荧光染料可用于带有HaloTag®的膜蛋白的标记


		图3. 用三个不同配体标记HaloTag® 融合蛋白。 HeLa细胞瞬时转染HaloTag® pHT2 表达克隆，使用5 μM HaloTag® TMR 配体 (Panel A); 10μM HaloTag® diAcFAM Ligand (Panel B); 25 μM HaloTag® Coumarin Ligand (Panel C).
蛋白共定位如果加了配体后固定HaloTag®融合蛋白的表达细胞，这些细胞可以进一步使用免疫化学实验对蛋白进行共定位(Figure 2)。抗 HaloTag® 的多克隆抗体也可以和其他抗体共同使用来进行共定位研究。
		图4. 固定表达 p65-HaloTag® 融合蛋白（使用HaloTag® TMR配体和抗体标记）的细胞。HeLa细胞瞬时转染p65-HaloTag®后使用TMR配体染色在37℃染色15分钟。随后使用1 μg/ml小鼠Anti-βIII微管蛋白固定细胞，使用Alexa Fluor 488-conjugated 二次孵育。 Panel A: TMR fluorescence. Panel B. Alexa Fluor-488 fluorescence. Panel C: Overlaid Alexa Fluor™-488 and TMR fluorescence and transmitted light. Panel D: Overlaid AlexaFluor-488 and TMR fluorescence. Please refer to Promega’s manual TM260 for this application.
蛋白-DNA相互作用起固定作用的配体(例如HaloLink™ Resin) 可以将HaloTag® 融合蛋白交联到DNA。这样就不用像经典的染色体免疫共沉淀(ChIP)实验那样使用抗体。详情请参考Promega #TM075的使用说明。
使用多重脉冲追踪标记研究蛋白转运使用不同的荧光配体可以在不同时间标记活细胞内的HaloTag®融合蛋白(Figure 3).详情参看Promega TM260使用说明。
		图5. 使用HaloTag®技术示踪蛋白。标记细胞0小时和12小时的显影显示这些标记的蛋白从细胞质移动到细胞膜。详细信息请参看 Svendsen, S., et al., (Promega Notes 95 (2007) 16–19).
蛋白富集, SDS-PAGE和western blot分析使用生物素配体和固定的亲和素可以用于HaloTag®融合蛋白的纯化、酶切验证、质谱分析或转录后修饰。使用荧光配体标记的HaloTag® 融合蛋白可以通过SDS-PAGE和 western blot分离(Figure 4).
		图6. 快速、高效、特异地标记哺乳动物细胞表达的HaloTag®蛋白。泳道1–6为CHO-K1对照细胞，泳道7–12为瞬时转染HaloTag® pHT2表达克隆的细胞，使用5 μM HaloTag® TMR Ligand 在37°C分别孵育0.5、1、2、5、15和30分钟.蛋白使用SDS-PAGE分离，通过Hitachi FMBIO® 荧光扫描仪分析。
HaloTag®是Promega公司专利产品，本公司获得授权使用，此页面的所有数据的使用都得到了Promega的允许。