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HaloTag® 技术

简介

HaloTag®是活细胞和固定细胞多色细胞成像实验的首选系统。这种多功能标签可以特异地与多种配体共价结合,能够在体内体外方便地对标签蛋白加荧光基团和纯化。

HaloTag®也能提高蛋白的表达量和可溶性,因此可以用于许多下游应用

 

技术

HaloTag®标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物,可与多种合成的HaloTag®配体有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端,并在原核或真核系统中表达。

 

与OmicsLink™即用型表达克隆结合使用

GeneCopoeia提供带有HaloTag®、CMV启动子、新霉素筛选标记的哺乳动物细胞和慢病毒的表达载体。 可以订购带有HaloTag®标签的20,000多种人和15,000多种小鼠的基因。

 

特异性

HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合,可以检测和固定标签蛋白。点击查看GeneCopoeia可以提供的基因和配体列表

 

严格的质检和质量保证

OmicsLink clone collection里的所有ORF表达克隆源于验证过的全长cDNA克隆或高质量的人源cDNA组织文库。

寄送之前,GeneCopoeia对所有的克隆进行了严格的质检过程。

  • 所有的ORF经过全长测序
  • 通过PCR验证序列长度
  • 通过酶切验证质粒的正确性

载体信息

带有HaloTag®的表达载体列表

Vector Promoter  Host cell Selection marker Tag Protease site
pReceiver-Lv64 CMV Stem/primary cell Neomycin N-HaloTag Tev protease
pReceiver-Lv65 CMV Stem/ primary cell Neomycin C-HaloTag Tev protease
pReceiver-M49 CMV Mammalian Neomycin N-HaloTag Tev protease
pReceiver-M50 CMV Mammalian Neomycin C-HaloTag Tev protease

 

 

HaloTag ORF cDNA clonesHaloTag ORF cDNA clones

 

图1. 带N-或C-端HaloTag®的OmicsLink即用型ORF表达克隆载体 图

 

How it works

Labeling of HaloTag proteins

图2. HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合,可以检测和固定标签蛋白

应用实例

HaloTag®技术的应用

蛋白定位

过膜或是不过膜的HaloTag®配体都可以标记胞内和膜上的蛋白。这些被标记的蛋白可以使用荧光显微镜来观察 (Figure 1). 不能过膜的荧光染料可用于带有HaloTag®的膜蛋白的标记

   
Live cells expressing HaloTag® fusion protein labeled with three different ligands  

图3. 用三个不同配体标记HaloTag® 融合蛋白。  HeLa细胞瞬时转染HaloTag® pHT2 表达克隆,使用5 μM HaloTag® TMR 配体 (Panel A); 10μM HaloTag® diAcFAM Ligand (Panel B);  25 μM HaloTag® Coumarin Ligand (Panel C).

蛋白共定位

如果加了配体后固定HaloTag®融合蛋白的表达细胞,这些细胞可以进一步使用免疫化学实验对蛋白进行共定位(Figure 2)。抗 HaloTag® 的多克隆抗体也可以和其他抗体共同使用来进行共定位研究。

   
Fixed cells expressing p65-HaloTag® fusion protein labeled with HaloTag® TMR ligand and an antibody to tubulin  

图4. 固定表达 p65-HaloTag® 融合蛋白(使用HaloTag® TMR配体和抗体标记)的细胞。HeLa细胞瞬时转染p65-HaloTag®后使用TMR配体染色在37℃染色15分钟。随后使用1 μg/ml小鼠Anti-βIII微管蛋白固定细胞,使用Alexa Fluor 488-conjugated 二次孵育。 Panel A: TMR fluorescence. Panel B. Alexa Fluor-488 fluorescence. Panel C: Overlaid Alexa Fluor™-488 and TMR fluorescence and transmitted light. Panel D: Overlaid AlexaFluor-488 and TMR fluorescence. Please refer to Promega’s manual TM260 for this application.

 

 

 

 

蛋白-DNA相互作用

起固定作用的配体(例如HaloLink™ Resin) 可以将HaloTag® 融合蛋白交联到DNA。这样就不用像经典的染色体免疫共沉淀(ChIP)实验那样使用抗体。详情请参考Promega #TM075的使用说明。

   

使用多重脉冲追踪标记研究蛋白转运

使用不同的荧光配体可以在不同时间标记活细胞内的HaloTag®融合蛋白(Figure 3).详情参看Promega TM260使用说明。

   
Spatial and temporal separation of proteins using HaloTag® technology  

图5. 使用HaloTag®技术示踪蛋白。标记细胞0小时和12小时的显影显示这些标记的蛋白从细胞质移动到细胞膜。详细信息请参看 Svendsen, S., et al., (Promega Notes 95 (2007) 16–19).

蛋白富集, SDS-PAGE和western blot分析

使用生物素配体和固定的亲和素可以用于HaloTag®融合蛋白的纯化、酶切验证、质谱分析或转录后修饰。使用荧光配体标记的HaloTag® 融合蛋白可以通过SDS-PAGE和 western blot分离(Figure 4).

   
Fast, efficient and highly specific labeling of the HaloTag® proteins expressed in mammalian cells  

图6. 快速、高效、特异地标记哺乳动物细胞表达的HaloTag®蛋白。泳道1–6为CHO-K1对照细胞,泳道7–12为瞬时转染HaloTag® pHT2表达克隆的细胞,使用5 μM HaloTag® TMR Ligand  在37°C分别孵育0.5、1、2、5、15和30分钟.蛋白使用SDS-PAGE分离,通过Hitachi FMBIO® 荧光扫描仪分析。

 

HaloTag®是Promega公司专利产品,本公司获得授权使用,此页面的所有数据的使用都得到了Promega的允许。

相关产品

Reporter and Affinity HaloTag® Ligands

HaloTag®配体众多,都是小分子化学物,能够在体外或体内与HaloTag®蛋白共价结合。这些配体由两个关键组分组成:一个通用的HaloTag®反应联结子,结合HaloTag®蛋白;另一个是功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

 HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合,可以检测和固定标签蛋白

HaloTag®配体和Anti-HaloTag抗体

Buy Catalog#  Ligand  Unit Qty  Excitation Maximum  Emission Maximum  Application Price ($USD)
G8272 HaloTag® diAcFAM Ligand 30μl at
1mM
1 494nm 526nm Intracellular protein labeling 489
G8251 HaloTag®  TMR Ligand 30μl at
5mM
1 555nm 585nm Intracellular protein labeling 489
G8581 HaloTag® Coumarin Ligand 30μl at
10mM
1 353nm 434nm Intracellular protein labeling 475
G9281* Anti HaloTag® pAB 200μg, 1mg/ml 1     Labeling after fixing or protein enrichment 225

 

 

*G9281必须和ORF表达克隆配套购买

 

HaloTag相关产品可以从Promega购买

Catalog #  Ligand  Excitation Maximum  Emission Maximum  Application
G2801 HaloTag® Oregon Green® Ligand 496nm 516nm Intracellular protein labeling
G1001 HaloTag® Alexa Fluor™ 488 Ligand 494nm 517nm surface membrane protein labeling
G8281 HaloTag® Biotin     Protein interaction and/or enrichment
G8591 HaloTag® PEG-Biotin     Protein enrichment
G1911 HaloLink™ Resin     ChIP Assay

 

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HaloTag®是Promega公司专利产品,本公司获得授权使用